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蛋白質絕對定量的新方法
日期：2015-03-16 00:00:00
生物學研究離不開定量。對于絕對定量，通常需要利用已知濃度的分子繪制標準曲線。最近，麻省理工學院、梅約診所和賽默飛世爾科技的研究人員在《Nature Communications》雜志上介紹了一種新方法，能利用串聯質譜儀對多個蛋白質進行絕對定量。這種方法稱為MARQUIS(Multiplex Absolute Regressed Quantification with Internal Standards)，依靠兩種現成的技術：重同位素標記的合成肽段以及質譜的同位素標記試劑。iTRAQ和TMT等試劑有著相同的分子量，但在質譜儀內產生特征的片段。
在MARQUIS方法中，對于每個待定量的肽段，研究人員建立重同位素標記的肽段。他們以不同的量混合這些肽段，并在組織或細胞裂解后立即將一種混合物加入每個生物樣品中。研究小組的負責人Forest White認為：“這是關鍵的一步。你要盡早加入這些肽段，這樣重同位素標記肽段和內源肽段的損失可同時發生。”隨后以同位素試劑標記樣品，并加入質譜儀中。每個肽段產生兩個峰：“重”峰代表合成的(加標)肽段，而“輕”峰代表內源性蛋白。通過定量前者碎片化所產生的標記離子，研究人員能產生每個肽段的標準曲線。之后他們能測定對應內源性肽段的信號，確定樣品中存在多少分子。
研究小組利用MARQUIS定量了EGFR信號通路中的酪氨酸磷酸化。在幾種配體刺激之后，他們在多個時間點定量了EGFR網絡內的磷酸化動力學，實現了EGFR磷酸化位點的定量比較，并證明了對于每種配體，受體磷酸化在性質上相似，但數量上不同。他們還培養了膠質母細胞瘤異種移植物，并應用這種方法定量了EGFR激酶抑制的效果。“有了這種方法，你就能看到那兒有多少靶點，藥物是否命中靶點，以及更重要的是，靶點抑制是否有效阻斷了下游的磷酸化，”White說。
據介紹，MARQUIS能同時定量10個樣品中多達100種肽段。這只需要一臺串聯質譜儀(如三重四級桿)、市售的同位素標記試劑，以及重同位素標記的合成肽段。White 認為：“每個人都能實現。我們希望創建出一種相當簡單的方法，而不需要什么訣竅。”